普洱茶中黄酮类化学成分研究(1)
[摘要] 目的： 研究普洱茶Camellia sinensis var. assamica中黄酮类化学成分。
方法：利用各种色谱技术进行分离，利用波谱方法结合化合物的理化性质确定结构。
结果：最终分离、鉴定了11个黄酮类化合物，分别为：山柰酚(1)，槲皮素(2)，山柰酚，3-O，β，D-葡萄糖苷(3)，山柰酚，3-O，β，D-芸香糖苷(4)，芹菜素6-C，α，L-阿拉伯糖，8-C，β，D-葡萄糖苷(5)，牡荆素，4″-O，β，D-葡萄糖苷(6)，山柰酚，3-O，α，L-鼠李糖基(1→3)α，L-鼠李糖基(1→6)β，D-葡萄糖苷(7)，槲皮素，3-O，β，D-葡萄糖苷(8)，芦丁(9)，槲皮素，3-O，α，L-鼠李糖苷(10)，杨梅素，3-O，β，D-葡萄糖苷(11)。
结论：化合物5～7，10，11均首次从普洱茶中分离得到。
, 百拇医药
[关键词]普洱茶；黄酮；化学成分
普洱茶是以云南特有的大叶茶Camellia sinensis(L.) var. assamica (Masters) Kitamura的晒青毛茶为原料，在高温高湿的环境下，利用微生物经特殊后发酵工艺生产而成的一种黑茶。普洱毛茶制成后，因其后期处理工序的关系可分为“生茶”和“熟茶”，生茶是指不经过渥堆发酵工序的普洱毛青，直接陈放让其自然红转成熟。“生茶”的转熟是完全依靠自然的环境条件，其间的变化相当缓慢，完全稳熟后的生茶，其陈香中仍留活泼生动的韵致，且逾时越久，其内香及活力亦越稳健、显露。“熟茶”是普洱毛茶再经加水，渥堆，翻堆，装袋，出袋，晒干等工序，让其快速红转而成。“熟茶”成熟后，仍需经一段时间的存放，以待其味质稳定，因熟茶堆闷红转过程较为急速，故其气韵味质较生茶平淡。现在所称之的普洱茶都是指经过现代“渥堆”工艺发酵的普洱熟茶，且市面上流通的普洱茶也是指此。
《本草纳目拾遗》记载：“普洱茶膏，黑如漆，醒酒第一，绿色更加；消食化痰，去淤，清胃生津”。现代临床研究也发现普洱茶具有很好的降脂降糖功效。目前，对于山茶科的茶叶的化学成分研究已经很多，但是对于普洱茶化学成分研究报道较少，主要发现普洱茶中含有带内酯环的儿茶素类衍生物[1]。为了进一步阐明普洱茶的物质基础，并为茶叶化学分类提供依据，本课题利用各种色谱、波谱技术对普洱茶的化学成分进行了系统研究，本文主要报道分离鉴定的11个黄酮类化合物。
, 百拇医药
1 材料
1H 和13C，NMR谱用BrukerAM，500 NMR谱仪以TMS为内标在DMSO-d2和丙酮-d2中测定。质谱用Agilent 6320 Ion Trap LC，MS质谱仪测定。柱色谱分离用填充剂有Sephadex LH，20，硅胶(100～200，200～300目)，Merck C18填料。以预制硅胶板进行TLC 检测，以FeCl3和H2SO4香草醛为显色剂。
普洱茶由大叶种的晒青毛茶后发酵制得，云南省龙生普洱茶有限公司提供，由北京大学医学部屠鹏飞教授鉴定为山茶科山茶属植物普洱茶C.sinensis var. assamica成熟叶片的后发酵熟茶，标本存放于北京大学中医药现代研究中心标本室。
2 提取与分离
, 百拇医药
取普洱茶1.5 kg，用15倍量90 ℃水提取3次，每次30 min，提取液经过浓缩，喷雾干燥得到600 g普洱茶粉，用水混悬溶解后，依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取。取乙酸乙酯层萃取物(140 g)，经硅胶柱色谱(氯仿，甲醇30∶1～2∶1)梯度洗脱划分为Fr.1，10共10个组分。Fr.2(5 g)析出黄色结晶，重结晶(氯仿，甲醇1∶1) 得化合物1(104 mg)。Fr.3(12.3 g)经硅胶柱色谱(氯仿，甲醇20∶1)和Sephadex LH，20(甲醇)分离纯化得化合物2(22 mg)，3(34 mg)。Fr.4(7.1 g)经Sephadex LH，20(甲醇)和C18反相柱色谱(70%甲醇)分离纯化得化合物4(17 mg)，5(21 mg)。Fr.5(3.2g)经Sephadex，LH，20(30%丙酮)分离纯化得化合物6(11 mg)。Fr.6(9.8 g)经Sephadex LH，20(30%～50%丙酮)梯度洗脱和C18反相柱色谱(10%～30%甲醇)梯度洗脱分离纯化得化合物7(30 mg)。Fr.7(2.1g)经过Sephadex LH，20(50%甲醇)和半制备HPLC(乙腈，水13∶87)分离纯化得化合物8(3 mg)，9(3 mg)，10(8 mg)和11(8 mg)。
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3 结构鉴定
化合物1 黄色粉末，三氯化铁，铁氰化钾反应显蓝色，硫酸香草醛反应显黄色，显示为黄酮类化合物，ESI，MS m/z 285[M-H]-，经过与对照品TLC对照，3种展开条件下Rf相同，故鉴定该化合物为山柰酚。
化合物2 黄色粉末，三氯化铁，铁氰化钾反应显蓝色，硫酸香草醛反应显黄色，显示为黄酮类化合物。ESI，MS m/z 301[M+H]+；1H，NMR(DMSO-d6，300 MHz) δ： 6.17(1H，d，J=2.0 Hz，H，6)，6.40(1H，d，J=2.0 Hz，H，8)，6.89(1H，d， J=8.5 Hz，H，5′)，7.52(1H，dd，J=2.5，8.5 Hz，H，6′)，7.67(1H，d，J=2.5 Hz，H，2′)。以上数据与文献[2]报道的槲皮素数据一致。
化合物3 黄色粉末，三氯化铁，铁氰化钾反应显蓝色，硫酸香草醛反应显黄色，显示为黄酮类化合物。ESI，MS m/z 447[M-H]-，471[M+Na]+；1H，NMR(DMSO-d6，300 MHz) δ： 6.17(1H，d，J=2.0 Hz，H，6)，6.40(1H，d，J=2.0 Hz，H，8)，8.05(2H，d，J=8.5 Hz，H，2′，6′)，6.89(2H，d，J=8.5 Hz，H，3′，5′)，5.44(1H，d，J=7.6 Hz，H，1″)，5.38(1H，m，H，3″)，4.29(1H，br，H，2″)，5.09(1H，m，H，6″a)，4.95(1H，m，H，6″b)。以上数据与文献[2]报道的山柰酚，3-O，β，D-葡萄糖苷基本一致。, http://www.100md.com(张梁 屠鹏飞)
方法：利用各种色谱技术进行分离，利用波谱方法结合化合物的理化性质确定结构。
结果：最终分离、鉴定了11个黄酮类化合物，分别为：山柰酚(1)，槲皮素(2)，山柰酚，3-O，β，D-葡萄糖苷(3)，山柰酚，3-O，β，D-芸香糖苷(4)，芹菜素6-C，α，L-阿拉伯糖，8-C，β，D-葡萄糖苷(5)，牡荆素，4″-O，β，D-葡萄糖苷(6)，山柰酚，3-O，α，L-鼠李糖基(1→3)α，L-鼠李糖基(1→6)β，D-葡萄糖苷(7)，槲皮素，3-O，β，D-葡萄糖苷(8)，芦丁(9)，槲皮素，3-O，α，L-鼠李糖苷(10)，杨梅素，3-O，β，D-葡萄糖苷(11)。
结论：化合物5～7，10，11均首次从普洱茶中分离得到。
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[关键词]普洱茶；黄酮；化学成分
普洱茶是以云南特有的大叶茶Camellia sinensis(L.) var. assamica (Masters) Kitamura的晒青毛茶为原料，在高温高湿的环境下，利用微生物经特殊后发酵工艺生产而成的一种黑茶。普洱毛茶制成后，因其后期处理工序的关系可分为“生茶”和“熟茶”，生茶是指不经过渥堆发酵工序的普洱毛青，直接陈放让其自然红转成熟。“生茶”的转熟是完全依靠自然的环境条件，其间的变化相当缓慢，完全稳熟后的生茶，其陈香中仍留活泼生动的韵致，且逾时越久，其内香及活力亦越稳健、显露。“熟茶”是普洱毛茶再经加水，渥堆，翻堆，装袋，出袋，晒干等工序，让其快速红转而成。“熟茶”成熟后，仍需经一段时间的存放，以待其味质稳定，因熟茶堆闷红转过程较为急速，故其气韵味质较生茶平淡。现在所称之的普洱茶都是指经过现代“渥堆”工艺发酵的普洱熟茶，且市面上流通的普洱茶也是指此。
《本草纳目拾遗》记载：“普洱茶膏，黑如漆，醒酒第一，绿色更加；消食化痰，去淤，清胃生津”。现代临床研究也发现普洱茶具有很好的降脂降糖功效。目前，对于山茶科的茶叶的化学成分研究已经很多，但是对于普洱茶化学成分研究报道较少，主要发现普洱茶中含有带内酯环的儿茶素类衍生物[1]。为了进一步阐明普洱茶的物质基础，并为茶叶化学分类提供依据，本课题利用各种色谱、波谱技术对普洱茶的化学成分进行了系统研究，本文主要报道分离鉴定的11个黄酮类化合物。
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1 材料
1H 和13C，NMR谱用BrukerAM，500 NMR谱仪以TMS为内标在DMSO-d2和丙酮-d2中测定。质谱用Agilent 6320 Ion Trap LC，MS质谱仪测定。柱色谱分离用填充剂有Sephadex LH，20，硅胶(100～200，200～300目)，Merck C18填料。以预制硅胶板进行TLC 检测，以FeCl3和H2SO4香草醛为显色剂。
普洱茶由大叶种的晒青毛茶后发酵制得，云南省龙生普洱茶有限公司提供，由北京大学医学部屠鹏飞教授鉴定为山茶科山茶属植物普洱茶C.sinensis var. assamica成熟叶片的后发酵熟茶，标本存放于北京大学中医药现代研究中心标本室。
2 提取与分离
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取普洱茶1.5 kg，用15倍量90 ℃水提取3次，每次30 min，提取液经过浓缩，喷雾干燥得到600 g普洱茶粉，用水混悬溶解后，依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取。取乙酸乙酯层萃取物(140 g)，经硅胶柱色谱(氯仿，甲醇30∶1～2∶1)梯度洗脱划分为Fr.1，10共10个组分。Fr.2(5 g)析出黄色结晶，重结晶(氯仿，甲醇1∶1) 得化合物1(104 mg)。Fr.3(12.3 g)经硅胶柱色谱(氯仿，甲醇20∶1)和Sephadex LH，20(甲醇)分离纯化得化合物2(22 mg)，3(34 mg)。Fr.4(7.1 g)经Sephadex LH，20(甲醇)和C18反相柱色谱(70%甲醇)分离纯化得化合物4(17 mg)，5(21 mg)。Fr.5(3.2g)经Sephadex，LH，20(30%丙酮)分离纯化得化合物6(11 mg)。Fr.6(9.8 g)经Sephadex LH，20(30%～50%丙酮)梯度洗脱和C18反相柱色谱(10%～30%甲醇)梯度洗脱分离纯化得化合物7(30 mg)。Fr.7(2.1g)经过Sephadex LH，20(50%甲醇)和半制备HPLC(乙腈，水13∶87)分离纯化得化合物8(3 mg)，9(3 mg)，10(8 mg)和11(8 mg)。
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3 结构鉴定
化合物1 黄色粉末，三氯化铁，铁氰化钾反应显蓝色，硫酸香草醛反应显黄色，显示为黄酮类化合物，ESI，MS m/z 285[M-H]-，经过与对照品TLC对照，3种展开条件下Rf相同，故鉴定该化合物为山柰酚。
化合物2 黄色粉末，三氯化铁，铁氰化钾反应显蓝色，硫酸香草醛反应显黄色，显示为黄酮类化合物。ESI，MS m/z 301[M+H]+；1H，NMR(DMSO-d6，300 MHz) δ： 6.17(1H，d，J=2.0 Hz，H，6)，6.40(1H，d，J=2.0 Hz，H，8)，6.89(1H，d， J=8.5 Hz，H，5′)，7.52(1H，dd，J=2.5，8.5 Hz，H，6′)，7.67(1H，d，J=2.5 Hz，H，2′)。以上数据与文献[2]报道的槲皮素数据一致。
化合物3 黄色粉末，三氯化铁，铁氰化钾反应显蓝色，硫酸香草醛反应显黄色，显示为黄酮类化合物。ESI，MS m/z 447[M-H]-，471[M+Na]+；1H，NMR(DMSO-d6，300 MHz) δ： 6.17(1H，d，J=2.0 Hz，H，6)，6.40(1H，d，J=2.0 Hz，H，8)，8.05(2H，d，J=8.5 Hz，H，2′，6′)，6.89(2H，d，J=8.5 Hz，H，3′，5′)，5.44(1H，d，J=7.6 Hz，H，1″)，5.38(1H，m，H，3″)，4.29(1H，br，H，2″)，5.09(1H，m，H，6″a)，4.95(1H，m，H，6″b)。以上数据与文献[2]报道的山柰酚，3-O，β，D-葡萄糖苷基本一致。, http://www.100md.com(张梁 屠鹏飞)