基于HPLC指纹图谱的不同产地升麻质量评价研究(1)
[摘要] 建立不同产地升麻药材的指纹图谱。使用Kromasil色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相乙腈-0.1%甲酸溶液，梯度洗脱，柱温35 ℃，流速1.0 mL·min-1，检测波长254 nm。提取12个色谱峰作为指纹图谱共有峰，采用相似度评价、聚类分析、主成分分析等方法，对所收集的21批样品进行系统比较与归类。结果确定了12个共有峰，将不同产地的样品分为3类。该法重复性好，简便可靠，可以为不同产地升麻的质量控制和评价提供依据。
[关键词] 升麻；指纹图谱
升麻为毛茛科植物大三叶升麻Cimicifuga heracleifolia Kom.、兴安升麻C. dahurica (Turcz.) Maxim.或升麻C. foetida L.的干燥根茎[1]，主产于四川、青海、陕西、云南、东北等地，是我国传统中药材。升麻始载于《神农本草经》，列为上品，其味辛、微甘，微寒，归肺、脾、胃、大肠经，具有清热解毒、发表透疹、升举阳气的功能，用于风热头痛、齿痛、口疮等。
, 百拇医药
升麻在全国多个地区均有种植，但不同产地升麻的质量差异有待进一步研究。2010年版《中国药典》一部中，以异阿魏酸的含量作为其质量控制指标，已有研究报道将3种酚酸类成分作为升麻的质量控制指标[2]，对不同产地升麻进行质量评价，但数据处理较为简单。为了进一步研究并揭示不同产地升麻的质量差异，本试验采用指纹图谱结合多种化学计量学的数据处理方法进行分析，进而评价不同产地升麻的质量。
1 材料
日本岛津公司Shimadzu LC-20AB高效液相色谱系统，包括在线脱气机、Prominence SIL-20A自动进样器、SPD-M20A二极管阵列检测器、CTO-20A柱温箱；BS2242S电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；RE-52旋转蒸发仪(瑞士步琪)。
异阿魏酸(纯度99%，批号ZL1203089)、阿魏酸(纯度99%，批号ZL1203158)、咖啡酸对照品(纯度99%，批号ZL1202169)均购自南京泽朗医药科技有限公司；甲酸(分析纯，南京化学试剂有限公司)；乙腈(色谱纯，美国天地公司)；水(杭州娃哈哈公司)。
, http://www.100md.com
升麻药材共21批，经南京中医药大学陈建伟教授鉴定为正品，密封保存于阴凉干燥处。其来源见表1。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
Kromasil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B)，梯度洗脱，0～25 min，5%～13% A，25～60 min，13%～18% A，60～88 min，18%～28% A，88～110 min，28%～50% A，110～115 min，50%～60% A，115～120 min，60%～5% A，流速1.0 mL·min-1；测定波长254 nm；柱温35 ℃；进样量10 μL。
2.2 混合对照溶液的制备
, http://www.100md.com 精密称取异阿魏酸、阿魏酸及咖啡酸对照品适量，置棕色量瓶中，加甲醇制得每毫升分别含异阿魏酸0.443 mg，阿魏酸0.451 mg，咖啡酸0.439 mg的混合溶液，摇匀，作为对照品储备液。
2.3 供试品溶液制备
取升麻药材粉末约1 g，精密称定，置150 mL圆底烧瓶中，加入75%乙醇20 mL，回流提取3次，每次1 h，滤过，滤液减压蒸干，用80%甲醇溶解并定容到10 mL量瓶中，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。
2.4 指纹图谱方法学考察
2.4.1 精密度试验 取6号升麻供试品溶液，连续进样6针，每次10 μL，考察色谱峰保留时间的一致性，结果表明，共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.05%～2.3%，1.24%～2.62%，说明各主要色谱峰保留时间与峰面积基本一致，符合指纹图谱的要求。
, http://www.100md.com
2.4.2 稳定性试验 精密吸取6号升麻供试品溶液10 μL，分别在0，2，4，8，16，24 h进行检测，结果表明，共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.05%～2.5%，0.93%～1.22%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.4.3 重复性试验 取同批号样品6份，按2.3项下方法制备样品，按照2.1项下色谱条件进样测定，结果表明，共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为1.24%～2.62%，1.62%～2.37%，符合指纹图谱的要求。
2.5 样品测定
按2.3项下方法制备21批供试品溶液，分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入到高效液相色谱仪测定，记录色谱图，共获得12个共有峰，通过对照品指认，其中3个共有峰分别为咖啡酸(1号峰)、异阿魏酸(2号峰)、阿魏酸(3号峰)，结果见图1。
, http://www.100md.com
2.6 指纹图谱的建立及分析
2.6.1 参比峰的选择 在各批次样品图谱中，2号色谱峰(异阿魏酸)分离度较好，为样品所有样品共有，故选择2号峰为参照峰。
2.6.2 指纹图谱的建立及相似度评价 将21批升麻样品色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(国家药典委员会2004A版)》，通过多点校正法对色谱峰进行自动匹配，生成升麻提取物的色谱指纹图谱共有模式，见图2。在分析检验模式下，以S6样品图谱作为参照图谱，进行相似度计算，见表2。结果表明，1，17，19，21号样品的相似度小于0.9，其他产地升麻药材的相似度均在0.9以上。
2.6.3 升麻样品聚类分析 本试验对21批升麻样品的HPLC指纹图谱进行聚类分析。其中数据源为共有峰的峰面积，所有的数据经过标准化处理，聚类方法为组间连接法，样品距离度采用欧式距离法，得到样品的聚类分析树状图，见图3。, http://www.100md.com(沈保家，秦昆明，张星海，刘启迪，蔡皓，刘晓，蔡宝昌)
[关键词] 升麻；指纹图谱
升麻为毛茛科植物大三叶升麻Cimicifuga heracleifolia Kom.、兴安升麻C. dahurica (Turcz.) Maxim.或升麻C. foetida L.的干燥根茎[1]，主产于四川、青海、陕西、云南、东北等地，是我国传统中药材。升麻始载于《神农本草经》，列为上品，其味辛、微甘，微寒，归肺、脾、胃、大肠经，具有清热解毒、发表透疹、升举阳气的功能，用于风热头痛、齿痛、口疮等。
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升麻在全国多个地区均有种植，但不同产地升麻的质量差异有待进一步研究。2010年版《中国药典》一部中，以异阿魏酸的含量作为其质量控制指标，已有研究报道将3种酚酸类成分作为升麻的质量控制指标[2]，对不同产地升麻进行质量评价，但数据处理较为简单。为了进一步研究并揭示不同产地升麻的质量差异，本试验采用指纹图谱结合多种化学计量学的数据处理方法进行分析，进而评价不同产地升麻的质量。
1 材料
日本岛津公司Shimadzu LC-20AB高效液相色谱系统，包括在线脱气机、Prominence SIL-20A自动进样器、SPD-M20A二极管阵列检测器、CTO-20A柱温箱；BS2242S电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；RE-52旋转蒸发仪(瑞士步琪)。
异阿魏酸(纯度99%，批号ZL1203089)、阿魏酸(纯度99%，批号ZL1203158)、咖啡酸对照品(纯度99%，批号ZL1202169)均购自南京泽朗医药科技有限公司；甲酸(分析纯，南京化学试剂有限公司)；乙腈(色谱纯，美国天地公司)；水(杭州娃哈哈公司)。
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升麻药材共21批，经南京中医药大学陈建伟教授鉴定为正品，密封保存于阴凉干燥处。其来源见表1。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
Kromasil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B)，梯度洗脱，0～25 min，5%～13% A，25～60 min，13%～18% A，60～88 min，18%～28% A，88～110 min，28%～50% A，110～115 min，50%～60% A，115～120 min，60%～5% A，流速1.0 mL·min-1；测定波长254 nm；柱温35 ℃；进样量10 μL。
2.2 混合对照溶液的制备
, http://www.100md.com 精密称取异阿魏酸、阿魏酸及咖啡酸对照品适量，置棕色量瓶中，加甲醇制得每毫升分别含异阿魏酸0.443 mg，阿魏酸0.451 mg，咖啡酸0.439 mg的混合溶液，摇匀，作为对照品储备液。
2.3 供试品溶液制备
取升麻药材粉末约1 g，精密称定，置150 mL圆底烧瓶中，加入75%乙醇20 mL，回流提取3次，每次1 h，滤过，滤液减压蒸干，用80%甲醇溶解并定容到10 mL量瓶中，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。
2.4 指纹图谱方法学考察
2.4.1 精密度试验 取6号升麻供试品溶液，连续进样6针，每次10 μL，考察色谱峰保留时间的一致性，结果表明，共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.05%～2.3%，1.24%～2.62%，说明各主要色谱峰保留时间与峰面积基本一致，符合指纹图谱的要求。
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2.4.2 稳定性试验 精密吸取6号升麻供试品溶液10 μL，分别在0，2，4，8，16，24 h进行检测，结果表明，共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为0.05%～2.5%，0.93%～1.22%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.4.3 重复性试验 取同批号样品6份，按2.3项下方法制备样品，按照2.1项下色谱条件进样测定，结果表明，共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD分别为1.24%～2.62%，1.62%～2.37%，符合指纹图谱的要求。
2.5 样品测定
按2.3项下方法制备21批供试品溶液，分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入到高效液相色谱仪测定，记录色谱图，共获得12个共有峰，通过对照品指认，其中3个共有峰分别为咖啡酸(1号峰)、异阿魏酸(2号峰)、阿魏酸(3号峰)，结果见图1。
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2.6 指纹图谱的建立及分析
2.6.1 参比峰的选择 在各批次样品图谱中，2号色谱峰(异阿魏酸)分离度较好，为样品所有样品共有，故选择2号峰为参照峰。
2.6.2 指纹图谱的建立及相似度评价 将21批升麻样品色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(国家药典委员会2004A版)》，通过多点校正法对色谱峰进行自动匹配，生成升麻提取物的色谱指纹图谱共有模式，见图2。在分析检验模式下，以S6样品图谱作为参照图谱，进行相似度计算，见表2。结果表明，1，17，19，21号样品的相似度小于0.9，其他产地升麻药材的相似度均在0.9以上。
2.6.3 升麻样品聚类分析 本试验对21批升麻样品的HPLC指纹图谱进行聚类分析。其中数据源为共有峰的峰面积，所有的数据经过标准化处理，聚类方法为组间连接法，样品距离度采用欧式距离法，得到样品的聚类分析树状图，见图3。, http://www.100md.com(沈保家，秦昆明，张星海，刘启迪，蔡皓，刘晓，蔡宝昌)