基于ITS序列的藏药“川布”的分子鉴定研究(1)
[摘要] 目的：对常用藏药川布进行品种整理。方法：野外实地考察，经典分类学鉴定，植物核糖体DNA内转录间隔区序列测定与分析。结果：确定西藏产川布的2种基原植物为大戟科大戟属的高山大戟Euphorbia stracheyi与大果大戟E、 wallichii；前期基础工作表明，在甘肃藏区所使用的川布，基原植物为甘肃大戟E、 kansuensis；序列分析显示，高山大戟E、 stracheyi与大果大戟E、 wallichii的完整序列(ITS1-5、8S-ITS2)总长度均为646 bp：其中ITS1区为261 bp，ITS2区为221 bp，5、8S编码区为164 bp；高山大戟E、 stracheyi的ITS 1区序列在72号位具有1个杂合位点(C/G)。结论：nrDNA ITS区序列在藏药川布及来源于大戟属的中药品种的鉴定中具有很好的种间分辨率，可用于川布及其相关品种的分子鉴定。
[关键词] 藏药；川布；ITS区；大戟属
[收稿日期] 2013-04-21
, http://www.100md.com
[基金项目] 国家自然科学基金项目(81173654)
[通信作者] *赵志礼，教授，博士生导师，主要从事中药资源与品种鉴定工作，E-mail： zhilzhao@sohu、com 川布( )为常用藏药之一，块根或全草入药，具缓泻，解毒等功效，其原植物涉及大戟科大戟属Euphorbia多种植物[1]，来源较为复杂。
多年来，本课题组开展了藏药的品种整理工作[2-4]。在实地考察中注意到，西藏所产的川布至少涉及该属2种植物，而在甘肃藏区所使用的川布，基原植物为其近缘种甘肃大戟E、 kansuensis Prokh、[3]。国产大戟属植物约80种，该属植物均具特殊的杯状聚伞花序(大戟花序)[5]，共性明显，种内个体营养器官变化幅度较大，各地川布来源的多样性及传统鉴定方法的局限性等原因，当务之急是开展深入的品种整理与鉴定工作。
植物核糖体DNA中的内转录间隔区序列(nrDNA ITS区)可以提供较丰富的变异位点和信息位点，已广泛应用于中药的品种鉴定[6-7]。为此，在前期工作的基础上[3]，对西藏地区所产川布品种进行实地调查与标本采集。应用形态学鉴定并结合DNA分子鉴定方法，确定其基原植物的系统学位置，测定并分析其nrDNA ITS区序列间的差异，以期为藏药川布DNA条形码的建立与品种鉴定提供基础资料。
, 百拇医药
1 材料与方法
1、1 植物材料与凭证标本 标本均为自采，每个居群至少采集3份标本，同时取新鲜叶片经硅胶快速干燥，备用。凭证标本经赵志礼教授鉴定并保存于上海中医药大学中药学院药用植物标本室(表1)。
1、2 nrDNA ITS区序列的测定 叶片总DNA提取采用改进的CTAB法[8]，ITS区的扩增引物为YP1(5′-GGAAGTAGAAGTCGTAACAAGG-3′)，YP4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[9]。PCR反应在20 μL的反应体系中进行，反应液中含10×Buffer 2 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)1、6 μL，上游引物YP1(10 μmol·L-1)0、6 μL，下游引物YP4(10 μmol·L-1)0、6 μL，dNTP Mix(10 mmol·L-1 each)0、5 μL，Taq DNA polymerase(5 U·μL-1)0、2 μL，2 μL稀释20倍的总DNA模板，加入去离子水补齐至20 μL。反应在PCR仪(Eppendorf Mastercycler Pro S)上进行，循环参数为：95 ℃预变性4 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共33个循环，最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经Axygen胶回收试剂盒纯化， ABI 3730xl DNA测序仪测序。
, http://www.100md.com
1、3 序列分析 为评价nrDNA ITS区在川布类藏药及大戟属药用植物的分子鉴定中的意义，以大戟属近缘植物大戟E、 pekinensis，续随子E、 lathyris，地锦草E、 humifusa为外类群，应用分子系统学软件MEGA 3、1进行序列分析及遗传距离的计算(Kimura 2-parameter)。序列分析用GenBank登录号见表1。
2 结果与分析
2、1 分类位置的确定 经标本的形态学观察与分类学鉴定，并查阅中国科学院植物研究所植物标本 表1 凭证标本与GenBank 登录号
Table 1 Species list， voucher and GenBank accession number
物种采集地点采集时间采集号生境海拔/mGenBank 登录号高山大戟Euphorbia stracheyi西藏拉萨2012-08-17杨耀华2012XZ001-A高山草坡4 072西藏拉萨2012-08-17杨耀华2012XZ001-B高山草坡4 072西藏拉萨2012-08-17杨耀华2012XZ001-C高山草坡4 072大果大戟E、 wallichii西藏工布江达2012-08-20杨耀华，赵志礼2012XZ003-A路边3 867西藏工布江达2012-08-20杨耀华，赵志礼2012XZ003-B路边3 867西藏工布江达2012-08-20杨耀华，赵志礼2012XZ003-C路边3 867甘肃大戟E、 kansuensis_____EU659768大戟E、 pekinensis_____AY594263续随子E、 lathyris_____AF537550地锦草E、 humifusa_____HQ645281
馆相关标本，确定西藏产川布的2种基原植物大戟科大戟属的高山大戟E、 stracheyi与大果大戟E、 wallichii。结合前期的基础工作，在甘肃藏区所使用的川布，基原植物为甘肃大戟E、 kansuensis [3]。, 百拇医药(杨耀华 赵志礼 嘎务 米玛 孟千万 倪梁红)
[关键词] 藏药；川布；ITS区；大戟属
[收稿日期] 2013-04-21
, http://www.100md.com
[基金项目] 国家自然科学基金项目(81173654)
[通信作者] *赵志礼，教授，博士生导师，主要从事中药资源与品种鉴定工作，E-mail： zhilzhao@sohu、com 川布( )为常用藏药之一，块根或全草入药，具缓泻，解毒等功效，其原植物涉及大戟科大戟属Euphorbia多种植物[1]，来源较为复杂。
多年来，本课题组开展了藏药的品种整理工作[2-4]。在实地考察中注意到，西藏所产的川布至少涉及该属2种植物，而在甘肃藏区所使用的川布，基原植物为其近缘种甘肃大戟E、 kansuensis Prokh、[3]。国产大戟属植物约80种，该属植物均具特殊的杯状聚伞花序(大戟花序)[5]，共性明显，种内个体营养器官变化幅度较大，各地川布来源的多样性及传统鉴定方法的局限性等原因，当务之急是开展深入的品种整理与鉴定工作。
植物核糖体DNA中的内转录间隔区序列(nrDNA ITS区)可以提供较丰富的变异位点和信息位点，已广泛应用于中药的品种鉴定[6-7]。为此，在前期工作的基础上[3]，对西藏地区所产川布品种进行实地调查与标本采集。应用形态学鉴定并结合DNA分子鉴定方法，确定其基原植物的系统学位置，测定并分析其nrDNA ITS区序列间的差异，以期为藏药川布DNA条形码的建立与品种鉴定提供基础资料。
, 百拇医药
1 材料与方法
1、1 植物材料与凭证标本 标本均为自采，每个居群至少采集3份标本，同时取新鲜叶片经硅胶快速干燥，备用。凭证标本经赵志礼教授鉴定并保存于上海中医药大学中药学院药用植物标本室(表1)。
1、2 nrDNA ITS区序列的测定 叶片总DNA提取采用改进的CTAB法[8]，ITS区的扩增引物为YP1(5′-GGAAGTAGAAGTCGTAACAAGG-3′)，YP4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[9]。PCR反应在20 μL的反应体系中进行，反应液中含10×Buffer 2 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)1、6 μL，上游引物YP1(10 μmol·L-1)0、6 μL，下游引物YP4(10 μmol·L-1)0、6 μL，dNTP Mix(10 mmol·L-1 each)0、5 μL，Taq DNA polymerase(5 U·μL-1)0、2 μL，2 μL稀释20倍的总DNA模板，加入去离子水补齐至20 μL。反应在PCR仪(Eppendorf Mastercycler Pro S)上进行，循环参数为：95 ℃预变性4 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共33个循环，最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经Axygen胶回收试剂盒纯化， ABI 3730xl DNA测序仪测序。
, http://www.100md.com
1、3 序列分析 为评价nrDNA ITS区在川布类藏药及大戟属药用植物的分子鉴定中的意义，以大戟属近缘植物大戟E、 pekinensis，续随子E、 lathyris，地锦草E、 humifusa为外类群，应用分子系统学软件MEGA 3、1进行序列分析及遗传距离的计算(Kimura 2-parameter)。序列分析用GenBank登录号见表1。
2 结果与分析
2、1 分类位置的确定 经标本的形态学观察与分类学鉴定，并查阅中国科学院植物研究所植物标本 表1 凭证标本与GenBank 登录号
Table 1 Species list， voucher and GenBank accession number
物种采集地点采集时间采集号生境海拔/mGenBank 登录号高山大戟Euphorbia stracheyi西藏拉萨2012-08-17杨耀华2012XZ001-A高山草坡4 072西藏拉萨2012-08-17杨耀华2012XZ001-B高山草坡4 072西藏拉萨2012-08-17杨耀华2012XZ001-C高山草坡4 072大果大戟E、 wallichii西藏工布江达2012-08-20杨耀华，赵志礼2012XZ003-A路边3 867西藏工布江达2012-08-20杨耀华，赵志礼2012XZ003-B路边3 867西藏工布江达2012-08-20杨耀华，赵志礼2012XZ003-C路边3 867甘肃大戟E、 kansuensis_____EU659768大戟E、 pekinensis_____AY594263续随子E、 lathyris_____AF537550地锦草E、 humifusa_____HQ645281
馆相关标本，确定西藏产川布的2种基原植物大戟科大戟属的高山大戟E、 stracheyi与大果大戟E、 wallichii。结合前期的基础工作，在甘肃藏区所使用的川布，基原植物为甘肃大戟E、 kansuensis [3]。, 百拇医药(杨耀华 赵志礼 嘎务 米玛 孟千万 倪梁红)