PEG修饰β—谷甾醇制备新型绞股蓝总皂苷长循环脂质体的研究(1)
[摘要] 目的：探讨用聚乙二醇(PEG)修饰β-谷甾醇(PEG-Sito)制备新型绞股蓝总皂苷长循环脂质体的可行性。方法：以丁二酸酐为连接臂连接β-谷甾醇与PEG 2000合成PEG-Sito；以鞘磷脂和PEG-Sito为膜材采用乙醇注入法制备绞股蓝总皂苷长循环脂质体；脂质体以鱼精蛋白沉淀法进行包封率的测定；1H-NMR验证PEG-Sito的合成；粒径、电位、AFM电镜表征该新型绞股蓝总皂苷长循环脂质体。结果：1H-NMR证实了PEG-Sito的合成成功，采用乙醇注入法用PEG-Sito为材料制备长循环脂质体的包封率为74.3%，粒径288.1 nm，电位-20.25 mV，电镜下呈规则圆形。结论：用PEG-Sito为材料制备绞股蓝总皂苷长循环脂质体方法可行，绞股蓝总皂苷包封率高，形态和粒径均较好。
[关键字]绞股蓝总皂苷；长循环脂质体；β-谷甾醇；聚乙二醇
脂质体由于具有缓释、增效、减毒、靶向等优点，是中药传递系统中最受关注的热点[1-2]。近年来发展的长循环脂质体或隐形脂质体(long-circulating liposomes， stealth liposomes)[3]是通过将聚乙二醇-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE) 镶嵌在脂质体双层膜之间，PEG 的长链在脂质体表面形成空间位阻和亲水保护层，能阻止吞噬细胞对脂质体的的识别和摄取而极大地延长脂质体的血循环时间，便于药物进入病变组织，提高治疗指数和疗效[4-5]，但由于磷脂价格较高，PEG修饰后价格更加昂贵，且DSPE，PEG均为大分子，与硅胶有很强的吸附性，合成后分离纯化相当困难，得率极低，大大限制了长循环脂质体在制剂领域中的应用[6]。
, 百拇医药
本课题组前期已论证了以不引发心血管疾病的植物甾醇替代胆固醇来稳定脂质体、构建脂质体的可行性[7]，又论证了采用新型磷脂——鞘磷脂制备高稳定性的脂质体的可行性[8]。在本课题中，笔者避开用PEG对磷脂修饰制备长循环脂质体的常规思路，采用PEG对价格相对低廉的小分子甾醇进行修饰，得到聚乙二醇-β-谷甾醇(PEG-Sito)，然后以PEG-Sito为长循环材料和近年来被发现具有显著的抑制肿瘤作用的绞股蓝总皂苷(gypenosides)为模型药，对用PEG-Sito制备绞股蓝总皂苷长循环脂质体的可行性进行了探讨，为中药长循环脂质体的开发提供一种新的思路，具有较大的理论及应用价值。
1 材料
Model RE-52A 型旋转蒸发仪(上海亚荣生物仪器公司)；AVYⅢ-500 MHz核磁共振仪(美国bruker公司)；360型傅立叶变换红外光谱仪(Wartars公司)；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；HZQ-X280恒温振荡培养箱(太仓市华美生化仪器厂)；BS210型电子天平；WFJ2000可见分光光度计；KBS-150型数控超声波细胞粉碎机(昆山市超声仪器有限公司)；SCZL-A型数字智能控温磁力搅拌器(郑州长城科工贸有限公司)；数显恒温水浴锅HH-2(国华电器有限公司)；原子力显微镜AFM(Veeco公司)；LGJ-10冷冻干燥仪(北京博医康实验仪器有限公司)。
, http://www.100md.com
绞股蓝总皂苷(陕西昂盛生物医药科技有限公司，批号20120119)；鱼精蛋白(Sigma公司，批号P4672)；绞股蓝皂苷对照品(阿拉丁，批号D100246)；香草醛(上海晶纯实业有限公司，批号v100115)；鞘磷脂(Sigma公司，批号E1028)；β-谷甾醇(杭州大阳化工有限公司，质量分数97%)；丁二酸酐(国家集团化学试剂有限公司)；4-二甲氨基吡啶(DMAP)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、磷钼酸均购于阿拉丁，其他试剂为分析纯。
2 方法与结果
2.1 PEG-Sito的合成[9]
2.1.1 PEG-Sito的合成 路线具体合成路线见图1。
2.1.2 β-谷甾醇衍生物的制备[10] 将β-谷甾醇(Sito)(2.50 g，6.03 mmol)，丁二酸酐(3.25 g，32.48 mmol)，DMAP(0.40 g，8.19 mmol)溶于50 mL二氯甲烷中，在45 ℃下剧烈搅拌回流48 h。二氯甲烷溶液用1 mol·L-1(50 mL×3)盐酸溶液洗涤，Na2SO4干燥在旋转蒸发仪上旋干，得白色固体(suc-Sito)2.80 g，收率90.3%。β-谷甾醇衍生物(suc-Sito)经薄层色谱(TLC) 鉴定，Rf=0.7(氯仿-甲醇12∶1，5%磷钼酸显色) ；1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.37(d，β-谷甾醇C6-H，1H)，4.63(q，β-谷甾醇C3-H，1H)，2.68(t，丁二酸CH2，2H)，2.61(t，丁二酸CH2，2H)， 2.31(d，β-谷甾醇C4-H，2H)。
, 百拇医药
2.1.3 PEG-Sito的制备[11] 将suc-Sito(2.2 g，4.27 mmol)，PEG 2000(12.02 g，6.01 mmol)，DMAP(0.49 g， 4.01 mmol)，EDC(0.85 g，4.43 mmol)溶于50 mL二氯甲烷中，常温下搅拌48 h。二氯甲烷溶液用1 mol·L-1(100 mL×3)盐酸溶液洗涤，Na2SO4干燥，过滤，旋干。粗品经硅胶(300～400目)快速柱色谱，二氯甲烷-甲醇(60∶1)洗脱，减压浓缩收集液，得黄色固体3.06 g，收率28.7%。PEG-Sito(3)经薄层色谱(TLC)鉴定，Rf=0.4(二氯甲烷-甲醇30∶1，5%磷钼酸、碘蒸气显色)；1H-NMR(500 MHz，CDCl3) δ： 5.37(d，C6-H，1H)，4. 63(q，C3-H，1H)，3.65(m，聚乙二醇-O-CH2 CH2-O-，约190H)，2.66(m，丁二酸CH2-CH2，4H)，2.31(d，β-谷甾醇C4-H，2H)。, 百拇医药(喻樊 杨锦明 李金娟)
[关键字]绞股蓝总皂苷；长循环脂质体；β-谷甾醇；聚乙二醇
脂质体由于具有缓释、增效、减毒、靶向等优点，是中药传递系统中最受关注的热点[1-2]。近年来发展的长循环脂质体或隐形脂质体(long-circulating liposomes， stealth liposomes)[3]是通过将聚乙二醇-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE) 镶嵌在脂质体双层膜之间，PEG 的长链在脂质体表面形成空间位阻和亲水保护层，能阻止吞噬细胞对脂质体的的识别和摄取而极大地延长脂质体的血循环时间，便于药物进入病变组织，提高治疗指数和疗效[4-5]，但由于磷脂价格较高，PEG修饰后价格更加昂贵，且DSPE，PEG均为大分子，与硅胶有很强的吸附性，合成后分离纯化相当困难，得率极低，大大限制了长循环脂质体在制剂领域中的应用[6]。
, 百拇医药
本课题组前期已论证了以不引发心血管疾病的植物甾醇替代胆固醇来稳定脂质体、构建脂质体的可行性[7]，又论证了采用新型磷脂——鞘磷脂制备高稳定性的脂质体的可行性[8]。在本课题中，笔者避开用PEG对磷脂修饰制备长循环脂质体的常规思路，采用PEG对价格相对低廉的小分子甾醇进行修饰，得到聚乙二醇-β-谷甾醇(PEG-Sito)，然后以PEG-Sito为长循环材料和近年来被发现具有显著的抑制肿瘤作用的绞股蓝总皂苷(gypenosides)为模型药，对用PEG-Sito制备绞股蓝总皂苷长循环脂质体的可行性进行了探讨，为中药长循环脂质体的开发提供一种新的思路，具有较大的理论及应用价值。
1 材料
Model RE-52A 型旋转蒸发仪(上海亚荣生物仪器公司)；AVYⅢ-500 MHz核磁共振仪(美国bruker公司)；360型傅立叶变换红外光谱仪(Wartars公司)；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；HZQ-X280恒温振荡培养箱(太仓市华美生化仪器厂)；BS210型电子天平；WFJ2000可见分光光度计；KBS-150型数控超声波细胞粉碎机(昆山市超声仪器有限公司)；SCZL-A型数字智能控温磁力搅拌器(郑州长城科工贸有限公司)；数显恒温水浴锅HH-2(国华电器有限公司)；原子力显微镜AFM(Veeco公司)；LGJ-10冷冻干燥仪(北京博医康实验仪器有限公司)。
, http://www.100md.com
绞股蓝总皂苷(陕西昂盛生物医药科技有限公司，批号20120119)；鱼精蛋白(Sigma公司，批号P4672)；绞股蓝皂苷对照品(阿拉丁，批号D100246)；香草醛(上海晶纯实业有限公司，批号v100115)；鞘磷脂(Sigma公司，批号E1028)；β-谷甾醇(杭州大阳化工有限公司，质量分数97%)；丁二酸酐(国家集团化学试剂有限公司)；4-二甲氨基吡啶(DMAP)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、磷钼酸均购于阿拉丁，其他试剂为分析纯。
2 方法与结果
2.1 PEG-Sito的合成[9]
2.1.1 PEG-Sito的合成 路线具体合成路线见图1。
2.1.2 β-谷甾醇衍生物的制备[10] 将β-谷甾醇(Sito)(2.50 g，6.03 mmol)，丁二酸酐(3.25 g，32.48 mmol)，DMAP(0.40 g，8.19 mmol)溶于50 mL二氯甲烷中，在45 ℃下剧烈搅拌回流48 h。二氯甲烷溶液用1 mol·L-1(50 mL×3)盐酸溶液洗涤，Na2SO4干燥在旋转蒸发仪上旋干，得白色固体(suc-Sito)2.80 g，收率90.3%。β-谷甾醇衍生物(suc-Sito)经薄层色谱(TLC) 鉴定，Rf=0.7(氯仿-甲醇12∶1，5%磷钼酸显色) ；1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.37(d，β-谷甾醇C6-H，1H)，4.63(q，β-谷甾醇C3-H，1H)，2.68(t，丁二酸CH2，2H)，2.61(t，丁二酸CH2，2H)， 2.31(d，β-谷甾醇C4-H，2H)。
, 百拇医药
2.1.3 PEG-Sito的制备[11] 将suc-Sito(2.2 g，4.27 mmol)，PEG 2000(12.02 g，6.01 mmol)，DMAP(0.49 g， 4.01 mmol)，EDC(0.85 g，4.43 mmol)溶于50 mL二氯甲烷中，常温下搅拌48 h。二氯甲烷溶液用1 mol·L-1(100 mL×3)盐酸溶液洗涤，Na2SO4干燥，过滤，旋干。粗品经硅胶(300～400目)快速柱色谱，二氯甲烷-甲醇(60∶1)洗脱，减压浓缩收集液，得黄色固体3.06 g，收率28.7%。PEG-Sito(3)经薄层色谱(TLC)鉴定，Rf=0.4(二氯甲烷-甲醇30∶1，5%磷钼酸、碘蒸气显色)；1H-NMR(500 MHz，CDCl3) δ： 5.37(d，C6-H，1H)，4. 63(q，C3-H，1H)，3.65(m，聚乙二醇-O-CH2 CH2-O-，约190H)，2.66(m，丁二酸CH2-CH2，4H)，2.31(d，β-谷甾醇C4-H，2H)。, 百拇医药(喻樊 杨锦明 李金娟)