黄花蒿品种(品系)群体遗传结构及遗传多样性的SCoT分析(1)
[摘要]利用SCoT分子标记分析国内外8个黄花蒿品种(品系)群体的遗传结构及遗传多样性，运用POPGENE软件计算相关遗传参数，UPGMA方法聚类生成树状图。结果表明：20条引物共检测到145个扩增位点，其中多态位点122个；物种水平上，PPB=84.1%， H=0.217 3和Hsp=0.341 9，表明8个黄花蒿品种(品系)的遗传多样性较高；在群体水平上，各遗传参数的平均值为PPB=41.9%， H=0.121 5，Hpop=0.186 8，表明遗传多样性较低；Nei′s 基因多样性指数计算的遗传分化系数(Gst=0.441 0)说明大部分遗传变异存在于品种(品系)内；品种(品系)间存在基因流障碍(Nm=0.633 9)；品种(品系)间的Nei′s 遗传一致度(I)为0.755 1～0.985 7；8个品种(品系)聚为2个大类，具有相同或相似遗传背景的品种(品系)具有聚为一类的倾向。研究结果显示，在黄花蒿品种选育中应加强育成品种的交流、增加优异基因的相互渗透，从而拓宽黄花蒿的遗传基础。
[关键词]黄花蒿；遗传多样性；遗传结构；SCoT
, http://www.100md.com
黄花蒿Artemisia annua L.系菊科蒿属一年生草本植物。《中国药典》1985年版开始，规定黄花蒿为药用青蒿(Herba Artemisiae Annuae)的唯一基原植物，以其干燥的地上部分入药，具有清热解疟，驱风止痒的功效。20世纪70 年代，我国首次从黄花蒿中分离出抗疟活性成分青蒿素(artemisinin， QHS)，并研制出青蒿素类抗疟疾药，被WHO 指定为治疗疟疾专用药。作为世界市场青蒿类药物原料——黄花蒿的主产国，我国黄花蒿资源丰富。野生黄花蒿广泛分布于全国各地，但类型混杂，产量不稳定，青蒿素含量低[1]。目前黄花蒿主要来源于人工栽培，我国大部分地区均可种植，但各地青蒿素含量差异大，具有显著的生态地域性，青蒿素含量纬向变异明显，北部高纬度地区含量较低，南部含量较高[2-3] 。因此，筛选青蒿素高含量新品系成为众多研究者的选育目标，但现行的选育方法大多是从一个大群体中寻找自然变异类型，对品种(品系)的遗传多样性和遗传关系缺乏梳理。近年来不少研究者采用分子标记技术对黄花蒿野生种质资源遗传多样性进行了有益探索[4-8]，但在这些研究中，遗传关系主要是基于遗传距离或遗传相似性系数进行分析，对揭示材料间内在的遗传结构，尤其对反映杂交亲本间亲和性以及选配的参考作用有限。因此，本文采新型的目标起始密码子多态性(start codon targeted polymorphism，SCoT)分子标记技术[9]分析了8个黄花蒿品种(品系)的遗传结构，旨在了解供试材料的遗传结构，更好地明确其亲缘关系及其亲和性，以便于指导杂交育种中亲本的选配，为黄花蒿资源的合理利用和科学保护提供理论依据。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 样本采集和基因组DNA的制备 供试8个黄花蒿品种(品系)于2012年种植于重庆涪陵青蒿基地，具体命名和来源为：POP1，POP2均从英国约克大学引进(前者种植于重庆酉阳，后者种植于重庆涪陵)、POP3为“渝青1号”、POP4为“华立1号”、POP5～POP8均为重庆科瑞南海制药有限责任公司选出的品系。每个品种(品系)分析样本数为24个个体，由重庆市中药研究院李隆云研究员进行鉴定。根据均匀分布、随机取样的原则进行采样，于花期之前选取成熟植株分枝顶端上幼嫩的叶片，放入装有硅胶的自封袋内，使之快速干燥。回到实验室后，小心取出干叶片，用于基因组DNA的提取。
基因组DNA的制备采用北京天根植物基因组DNA提取试剂盒进行。1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品的质量和完整性，并用Smart SpeeTM3000型分光光度计(BIO-RAD)测定其浓度和纯度。提取的基因组DNA于-20 ℃条件下保存，扩增时将样品稀释为40 mg·L-1作为模板。
, 百拇医药
1.2 SCoT-PCR扩增与检测 SCoT引物采用Collard和Mackill[9]开发的引物，由上海生工生物工程有限公司合成。以随机抽取的2个供试材料基因组DNA为模板进行36条SCoT引物的筛选，最终确定20条扩增带型清晰、重复性好的引物用于正式PCR扩增。具体引物、序列见表1。
扩增反应在S1000TM Thermal Cycler 热循环仪(BIO-RAD)上进行。SCoT反应体系总体积15 μL，内含40 ng模板，0.4 μmol·L-1引物，1 U Taq DNA聚合酶，1.5 mmol·L-1 Mg2+，200 μmol·L-1 dNTP，1×PCR buffer。PCR扩增程序为：94 ℃预变性4 min；然后94 ℃变性1 min， 50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，36个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。
1.3 PCR产物检测 在1×TAE缓冲系统下，扩增产物加入核酸染料在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳分离，电压150 V。当溴酚蓝指示剂距离琼脂糖凝胶前沿约2～3 cm时停止电泳，在Gel Doc XR凝胶成像系统(BIO-RAD)上照相并记录扩增情况。
1.4 数据分析 观察PCR扩增产物凝胶电泳结果，统计清晰、稳定且易于辨认的DNA条带。根据条带的有无，将电泳结果转化为0/1数据矩阵(在同一等位基因位点上有带的赋值为1，无带的为0)。 利用POPGENE 1.31软件得到评价群体遗传多样性的参数：多态位点百分率(PPB)、Shannon′s多样性信息指数(Ho，在物种水平上为Hsp，在品系群体水平上为Hpop)、Nei′s基因多样度指数(H) 、观察等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、总的基因多样度(Ht )、品系内基因多样度(Hs)和评价群体遗传结构的参数：基因分化系数(Gst )、基因流(Nm)、Nei′s遗传距离(D)和遗传一致度(I)。采用UPGMA聚类分析各群体之间的遗传关系。, 百拇医药(陈大霞 崔广林 张雪 李隆云)
[关键词]黄花蒿；遗传多样性；遗传结构；SCoT
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黄花蒿Artemisia annua L.系菊科蒿属一年生草本植物。《中国药典》1985年版开始，规定黄花蒿为药用青蒿(Herba Artemisiae Annuae)的唯一基原植物，以其干燥的地上部分入药，具有清热解疟，驱风止痒的功效。20世纪70 年代，我国首次从黄花蒿中分离出抗疟活性成分青蒿素(artemisinin， QHS)，并研制出青蒿素类抗疟疾药，被WHO 指定为治疗疟疾专用药。作为世界市场青蒿类药物原料——黄花蒿的主产国，我国黄花蒿资源丰富。野生黄花蒿广泛分布于全国各地，但类型混杂，产量不稳定，青蒿素含量低[1]。目前黄花蒿主要来源于人工栽培，我国大部分地区均可种植，但各地青蒿素含量差异大，具有显著的生态地域性，青蒿素含量纬向变异明显，北部高纬度地区含量较低，南部含量较高[2-3] 。因此，筛选青蒿素高含量新品系成为众多研究者的选育目标，但现行的选育方法大多是从一个大群体中寻找自然变异类型，对品种(品系)的遗传多样性和遗传关系缺乏梳理。近年来不少研究者采用分子标记技术对黄花蒿野生种质资源遗传多样性进行了有益探索[4-8]，但在这些研究中，遗传关系主要是基于遗传距离或遗传相似性系数进行分析，对揭示材料间内在的遗传结构，尤其对反映杂交亲本间亲和性以及选配的参考作用有限。因此，本文采新型的目标起始密码子多态性(start codon targeted polymorphism，SCoT)分子标记技术[9]分析了8个黄花蒿品种(品系)的遗传结构，旨在了解供试材料的遗传结构，更好地明确其亲缘关系及其亲和性，以便于指导杂交育种中亲本的选配，为黄花蒿资源的合理利用和科学保护提供理论依据。
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1 材料与方法
1.1 样本采集和基因组DNA的制备 供试8个黄花蒿品种(品系)于2012年种植于重庆涪陵青蒿基地，具体命名和来源为：POP1，POP2均从英国约克大学引进(前者种植于重庆酉阳，后者种植于重庆涪陵)、POP3为“渝青1号”、POP4为“华立1号”、POP5～POP8均为重庆科瑞南海制药有限责任公司选出的品系。每个品种(品系)分析样本数为24个个体，由重庆市中药研究院李隆云研究员进行鉴定。根据均匀分布、随机取样的原则进行采样，于花期之前选取成熟植株分枝顶端上幼嫩的叶片，放入装有硅胶的自封袋内，使之快速干燥。回到实验室后，小心取出干叶片，用于基因组DNA的提取。
基因组DNA的制备采用北京天根植物基因组DNA提取试剂盒进行。1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品的质量和完整性，并用Smart SpeeTM3000型分光光度计(BIO-RAD)测定其浓度和纯度。提取的基因组DNA于-20 ℃条件下保存，扩增时将样品稀释为40 mg·L-1作为模板。
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1.2 SCoT-PCR扩增与检测 SCoT引物采用Collard和Mackill[9]开发的引物，由上海生工生物工程有限公司合成。以随机抽取的2个供试材料基因组DNA为模板进行36条SCoT引物的筛选，最终确定20条扩增带型清晰、重复性好的引物用于正式PCR扩增。具体引物、序列见表1。
扩增反应在S1000TM Thermal Cycler 热循环仪(BIO-RAD)上进行。SCoT反应体系总体积15 μL，内含40 ng模板，0.4 μmol·L-1引物，1 U Taq DNA聚合酶，1.5 mmol·L-1 Mg2+，200 μmol·L-1 dNTP，1×PCR buffer。PCR扩增程序为：94 ℃预变性4 min；然后94 ℃变性1 min， 50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，36个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。
1.3 PCR产物检测 在1×TAE缓冲系统下，扩增产物加入核酸染料在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳分离，电压150 V。当溴酚蓝指示剂距离琼脂糖凝胶前沿约2～3 cm时停止电泳，在Gel Doc XR凝胶成像系统(BIO-RAD)上照相并记录扩增情况。
1.4 数据分析 观察PCR扩增产物凝胶电泳结果，统计清晰、稳定且易于辨认的DNA条带。根据条带的有无，将电泳结果转化为0/1数据矩阵(在同一等位基因位点上有带的赋值为1，无带的为0)。 利用POPGENE 1.31软件得到评价群体遗传多样性的参数：多态位点百分率(PPB)、Shannon′s多样性信息指数(Ho，在物种水平上为Hsp，在品系群体水平上为Hpop)、Nei′s基因多样度指数(H) 、观察等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、总的基因多样度(Ht )、品系内基因多样度(Hs)和评价群体遗传结构的参数：基因分化系数(Gst )、基因流(Nm)、Nei′s遗传距离(D)和遗传一致度(I)。采用UPGMA聚类分析各群体之间的遗传关系。, 百拇医药(陈大霞 崔广林 张雪 李隆云)