大黄酸调控mTOR信号通路活性抑制肾小管上皮细胞自噬蛋白表达的分子机制(1)
[摘要] 目的：探讨大黄酸抑制饥饿诱导的肾小管上皮(NRK-52E)细胞自噬蛋白的作用和分子机制。方法：用Hank′s平衡盐溶液(Hank′s balanced salt solution，HBSS)诱导NRK-52E细胞产生饥饿状态，在干预后的各时间点(0，0.5，1，2，6 h)，首先，检测细胞自噬标志性蛋白——哺乳动物同族物微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)I/II的表达水平；其次，检测细胞哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)表达及其磷酸化水平(phosphorylated-mTOR Ser2448，p-mTOR S2448)；然后，以大黄酸(5 mg·L-1)、HBSS(1 mL)以及mTOR抑制剂雷帕霉素(100 nmol·L-1)单独或联合干预，分别检测其LC3 I/II，mTOR，p-mTOR S2448蛋白表达水平的变化。结果：HBSS诱导NRK-52E细胞LC3 II蛋白高表达、p-mTOR S2448蛋白低表达；大黄酸与HBSS联合干预可以逆转HBSS诱导的NRK-52E细胞LC3 II和p-mTOR S2448蛋白表达水平；雷帕霉素与大黄酸、HBSS联合干预可以恢复HBSS诱导的NRK-52E细胞LC3 II蛋白表达水平。结论：HBSS抑制mTOR信号通路活性而诱导肾小管上皮细胞发生自噬；大黄酸调控mTOR信号通路活性而抑制肾小管上皮细胞自噬蛋白的表达，这可能就是其干预细胞自噬的作用和分子机制。
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[关键词] 大黄酸；自噬；mTOR信号通路；肾小管上皮细胞；雷帕霉素
自噬(autophagy)是真核细胞内一种溶酶体依赖性蛋白降解过程，主要分为巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侣介导性自噬(chaperon-mediated autophagy，CMA)，其中，巨自噬(简称为自噬)在细胞内最为普遍[1]。研究表明[2-3]，自噬在饥饿、缺氧、缺血/再灌注和感染等条件下可被激活，并且，在维持细胞内环境稳定、调控能量代谢等方面发挥着重要作用。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)可以调控细胞周期及其增殖和凋亡过程，同时，作为自噬的主要调节剂，它能够抑制细胞自噬[4]。然而，对于肾小管上皮细胞而言，在生理和病理条件下，自噬对其作用究竟是怎样的？是否可以被临床上常用的“保肾”中药或雷帕霉素所影响？目前还不是很明确[5]。
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据报道[6]，自噬与凋亡之间有着密切的联系。借助腺嘌呤诱导的肾间质纤维化模型鼠，笔者发现，大黄附子汤(由大黄、附子、细辛组成)可以通过调控JNK/Bcl-2信号通路而改善模型鼠肾小管上皮细胞凋亡和肾间质纤维化[7]。作为大黄附子汤君药之一的大黄，其主要成分——大黄酸(rhein)在体内外可以调节肾小管上皮细胞转分化，改善肾纤维化[8-9]，那么，大黄酸是否在体外可以影响肾小管上皮细胞自噬，并通过mTOR信号通路而发挥调节作用呢？笔者采用Hank′s 平衡盐溶液(Hank′s balanced salt solution，HBSS)诱导大鼠肾小管上皮(NRK-52E)细胞饥饿状态而激活其自噬，与雷帕霉素相对照，试图阐明大黄酸通过mTOR信号通路干预NRK-52E细胞自噬的作用和分子机制。
1 材料与方法
1.1 药物与试剂 大黄酸(用0.1 mol·L-1NaOH配置成1 g·L-1溶液)、雷帕霉素(用二甲基亚砜配置成100 μmol·L-1溶液)购自美国Sigma-Aldrich公司；Dulbecco′s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12(DMEM/F12)培养基、胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)、青霉素链霉素溶液、Hank′s 平衡盐溶液(HBSS)购自美国HyClone公司；溴酚蓝(bromophenol blue，BPB)、二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)和BSA(bovine serum albumin)购自BioSharp公司；磷酸酶抑制剂(phosphatase inhibitor cocktail)和Chemi-Lumi One L发光液购自日本Nacalai公司；蛋白酶抑制剂、显影定影试剂盒购自碧云天公司；蛋白相对分子质量Marker购自美国Thermo Scientific公司；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜购自Millipore公司；兔抗大鼠哺乳动物同族物微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)I/II抗体、兔抗大鼠mTOR抗体、兔抗大鼠磷酸化mTOR(phosphorylated-mTOR Ser2448，p-mTOR S2448)抗体、兔抗大鼠β-actin抗体、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的羊抗兔IgG抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；X光胶片购自Kodak公司。
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1.2 仪器 细胞培养箱(日本SANYO公司)；奥林巴斯CK40型倒置显微镜；Western blot设备(美国BioRad公司)。
1.3 细胞培养和干预措施 大鼠肾小管上皮细胞株(NRK-52E)由日本山梨大学分子信号教研室Kitamura教授惠赠。NRK-52E细胞从液氮中取出后，常规复苏，接种于细胞培养基(95%DMEM/F12+5%FBS，含1%青霉素链霉素溶液)，置于细胞培养箱中进行培养(37 ℃、饱和湿度、5%CO2)；将细胞以2×105个/孔的密度铺板至12孔板中，按各个实验的不同时间点将培养基换成HBSS 1 mL，再分别添加大黄酸(5 mg·L-1)和雷帕霉素(100 nmol·L-1)进行干预。, 百拇医药(涂玥 孙伟 顾刘宝 万毅刚 胡浩 刘红)
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[关键词] 大黄酸；自噬；mTOR信号通路；肾小管上皮细胞；雷帕霉素
自噬(autophagy)是真核细胞内一种溶酶体依赖性蛋白降解过程，主要分为巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侣介导性自噬(chaperon-mediated autophagy，CMA)，其中，巨自噬(简称为自噬)在细胞内最为普遍[1]。研究表明[2-3]，自噬在饥饿、缺氧、缺血/再灌注和感染等条件下可被激活，并且，在维持细胞内环境稳定、调控能量代谢等方面发挥着重要作用。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)可以调控细胞周期及其增殖和凋亡过程，同时，作为自噬的主要调节剂，它能够抑制细胞自噬[4]。然而，对于肾小管上皮细胞而言，在生理和病理条件下，自噬对其作用究竟是怎样的？是否可以被临床上常用的“保肾”中药或雷帕霉素所影响？目前还不是很明确[5]。
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据报道[6]，自噬与凋亡之间有着密切的联系。借助腺嘌呤诱导的肾间质纤维化模型鼠，笔者发现，大黄附子汤(由大黄、附子、细辛组成)可以通过调控JNK/Bcl-2信号通路而改善模型鼠肾小管上皮细胞凋亡和肾间质纤维化[7]。作为大黄附子汤君药之一的大黄，其主要成分——大黄酸(rhein)在体内外可以调节肾小管上皮细胞转分化，改善肾纤维化[8-9]，那么，大黄酸是否在体外可以影响肾小管上皮细胞自噬，并通过mTOR信号通路而发挥调节作用呢？笔者采用Hank′s 平衡盐溶液(Hank′s balanced salt solution，HBSS)诱导大鼠肾小管上皮(NRK-52E)细胞饥饿状态而激活其自噬，与雷帕霉素相对照，试图阐明大黄酸通过mTOR信号通路干预NRK-52E细胞自噬的作用和分子机制。
1 材料与方法
1.1 药物与试剂 大黄酸(用0.1 mol·L-1NaOH配置成1 g·L-1溶液)、雷帕霉素(用二甲基亚砜配置成100 μmol·L-1溶液)购自美国Sigma-Aldrich公司；Dulbecco′s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12(DMEM/F12)培养基、胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)、青霉素链霉素溶液、Hank′s 平衡盐溶液(HBSS)购自美国HyClone公司；溴酚蓝(bromophenol blue，BPB)、二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)和BSA(bovine serum albumin)购自BioSharp公司；磷酸酶抑制剂(phosphatase inhibitor cocktail)和Chemi-Lumi One L发光液购自日本Nacalai公司；蛋白酶抑制剂、显影定影试剂盒购自碧云天公司；蛋白相对分子质量Marker购自美国Thermo Scientific公司；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜购自Millipore公司；兔抗大鼠哺乳动物同族物微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)I/II抗体、兔抗大鼠mTOR抗体、兔抗大鼠磷酸化mTOR(phosphorylated-mTOR Ser2448，p-mTOR S2448)抗体、兔抗大鼠β-actin抗体、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的羊抗兔IgG抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；X光胶片购自Kodak公司。
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1.2 仪器 细胞培养箱(日本SANYO公司)；奥林巴斯CK40型倒置显微镜；Western blot设备(美国BioRad公司)。
1.3 细胞培养和干预措施 大鼠肾小管上皮细胞株(NRK-52E)由日本山梨大学分子信号教研室Kitamura教授惠赠。NRK-52E细胞从液氮中取出后，常规复苏，接种于细胞培养基(95%DMEM/F12+5%FBS，含1%青霉素链霉素溶液)，置于细胞培养箱中进行培养(37 ℃、饱和湿度、5%CO2)；将细胞以2×105个/孔的密度铺板至12孔板中，按各个实验的不同时间点将培养基换成HBSS 1 mL，再分别添加大黄酸(5 mg·L-1)和雷帕霉素(100 nmol·L-1)进行干预。, 百拇医药(涂玥 孙伟 顾刘宝 万毅刚 胡浩 刘红)