基于分子亲和色谱技术的肉苁蓉低分子糖巨噬细胞激活作用靶点群鉴定与机制分析(1)
[摘要] 探究肉苁蓉低分子糖(LMSC)对RAW264.7小鼠巨噬细胞的激活作用靶点蛋白群及相关作用机制。该研究首先通过测定巨噬细胞吞噬活性以及NO释放量来评价LMSC对RAW264.7巨噬细胞的激活作用。实验结果显示，LMSC在0.25～2 g·L-1给药浓度可显著提高RAW264.7细胞的吞噬活性及NO的释放量，提示具有巨噬细胞激活作用。通过构建LMSC键合的环氧活化琼脂糖固相微球作为亲和介质，捕获RAW264.7细胞裂解液中特异性结合靶标蛋白；对高分辨质谱鉴定获得的LMSC靶标蛋白群进行信号通路富集分析，探讨LMSC巨噬细胞激活作用相关机制。实验共获得Eef2等24个LMSC靶点蛋白，分别涉及Fcγ受体依赖的吞噬、TNF-α NF-κB信号通路、糖酵解/糖原异生以及柠檬酸(TCA)循环和呼吸电子运输过程等10条巨噬细胞激活相关信号通路。以上结果提示LMSC通过作用于多个靶点进而调节细胞吞噬、NF-κB信号通路以及糖代谢途径最终实现对RAW264.7巨噬细胞激活作用。
[关键词] 肉苁蓉； 低分子糖； 巨噬细胞激活； 分子亲和色谱； 靶点识别； 作用机制分析
, http://www.100md.com
[Abstract] This study aims to investigate the targets and targets-involved mechanism for the macrophage activation of low molecular weight saccharides from Cistanche deserticola (LMSC). The phagocytic activity and NO release of RAW264.7 cells were detected， and results showed that LMSC exerts immune activation effect by significantly increasing the phagocytic activity and NO release. LMSC-conjugated epoxy-activated sepharose beads were prepared as affinity reagent to capture the target proteins. Twenty-four proteins such as Eef2 were identified by LC-MS/MS analysis. Pathway enrichment analysis showed LMSC activated RAW264.7 cells by regulating Fcgamma receptor dependent phagocytosis， TNF-alpha NF-κB signaling pathway， glycolysis/gluconeogenesis and the citric acid cycle and respiratory electron transport pathway.
, 百拇医药
[Key words] Cistanche deserticola； low molecular weight saccharides； macrophage activation； molecular affinity chromatography； target identification； mechanism analysis
肉蓯蓉Cistanches Herba是我国著名传统补益中药，具有补肾阳、益精血、润肠通便[1]之功效，有“沙漠人参”之称。现代分析化学研究表明肉苁蓉中含有多种糖类成分，包括以果糖等为主的单糖化合物、蔗糖等寡糖化合物以及含ACDP-2等多糖，是肉苁蓉发挥免疫调节、通便等作用的显效物质[2-5]。肉苁蓉多糖被广泛报道为一类具有免疫调节作用的活性成分，低分子糖类(LMSC)如寡糖和单糖却鲜为研究。本课题组一项对肉苁蓉中主要活性部位进行巨噬细胞激活作用的研究发现，低分子糖是一类具有巨噬细胞激活作用的活性成分，但其免疫激活作用靶点及作用机制目前仍不明确。
, 百拇医药
分子亲和色谱是一种通过固定相特异性结合目标分子从而实现分离纯化目的色谱方法[6]。该方法具有高亲和力与高专一性，尤其适用于目标产物浓度极低的有机复杂体系[7]，近年来逐步发展成为天然药物靶标识别的有力工具。本研究利用基于分子亲和色谱法的小分子靶标蛋白捕获技术识别并鉴定具有巨噬细胞激活作用的LMSC靶点蛋白群。通过生物信息学分析，获得靶标群的信号调节通路信息，以此探讨LMSC的免疫调节活性及相关机制。
1 材料
1.1 细胞 小鼠巨噬细胞系RAW264.7购自中国医学科学院细胞中心。
1.2 药物与试剂 胎牛血清(FBS)购自德国PAN Biotech公司；抗生素、DMEM高糖培养基与6×蛋白上样缓冲液均购自中科迈晨科技有限公司。肉苁蓉低分子糖由本课题组自制，经HPLC法测定主要含有甘露醇(16.53%)、蔗糖(8.34%)、果糖(25.38%)、葡萄糖(7.75%)等单体成分。大肠杆菌脂多糖(lipopolysaccharide from Escherichia coli O55：B5，LPS)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)与0.33%中性红溶液均购自美国Sigma-Aldrich公司。一氧化氮(NO)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。环氧活化琼脂糖凝胶(Epoxy-activated Sepharose6B)购自瑞典GE healthcare公司。快速银染试剂盒购自碧云天生物技术研究所。质谱用甲酸和乙腈均购自美国Thermo Fisher Scientific公司。其余试剂均为国产分析纯。, 百拇医药(王丽超 刘丹 姜勇 屠鹏飞 曾克武)
[关键词] 肉苁蓉； 低分子糖； 巨噬细胞激活； 分子亲和色谱； 靶点识别； 作用机制分析
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[Abstract] This study aims to investigate the targets and targets-involved mechanism for the macrophage activation of low molecular weight saccharides from Cistanche deserticola (LMSC). The phagocytic activity and NO release of RAW264.7 cells were detected， and results showed that LMSC exerts immune activation effect by significantly increasing the phagocytic activity and NO release. LMSC-conjugated epoxy-activated sepharose beads were prepared as affinity reagent to capture the target proteins. Twenty-four proteins such as Eef2 were identified by LC-MS/MS analysis. Pathway enrichment analysis showed LMSC activated RAW264.7 cells by regulating Fcgamma receptor dependent phagocytosis， TNF-alpha NF-κB signaling pathway， glycolysis/gluconeogenesis and the citric acid cycle and respiratory electron transport pathway.
, 百拇医药
[Key words] Cistanche deserticola； low molecular weight saccharides； macrophage activation； molecular affinity chromatography； target identification； mechanism analysis
肉蓯蓉Cistanches Herba是我国著名传统补益中药，具有补肾阳、益精血、润肠通便[1]之功效，有“沙漠人参”之称。现代分析化学研究表明肉苁蓉中含有多种糖类成分，包括以果糖等为主的单糖化合物、蔗糖等寡糖化合物以及含ACDP-2等多糖，是肉苁蓉发挥免疫调节、通便等作用的显效物质[2-5]。肉苁蓉多糖被广泛报道为一类具有免疫调节作用的活性成分，低分子糖类(LMSC)如寡糖和单糖却鲜为研究。本课题组一项对肉苁蓉中主要活性部位进行巨噬细胞激活作用的研究发现，低分子糖是一类具有巨噬细胞激活作用的活性成分，但其免疫激活作用靶点及作用机制目前仍不明确。
, 百拇医药
分子亲和色谱是一种通过固定相特异性结合目标分子从而实现分离纯化目的色谱方法[6]。该方法具有高亲和力与高专一性，尤其适用于目标产物浓度极低的有机复杂体系[7]，近年来逐步发展成为天然药物靶标识别的有力工具。本研究利用基于分子亲和色谱法的小分子靶标蛋白捕获技术识别并鉴定具有巨噬细胞激活作用的LMSC靶点蛋白群。通过生物信息学分析，获得靶标群的信号调节通路信息，以此探讨LMSC的免疫调节活性及相关机制。
1 材料
1.1 细胞 小鼠巨噬细胞系RAW264.7购自中国医学科学院细胞中心。
1.2 药物与试剂 胎牛血清(FBS)购自德国PAN Biotech公司；抗生素、DMEM高糖培养基与6×蛋白上样缓冲液均购自中科迈晨科技有限公司。肉苁蓉低分子糖由本课题组自制，经HPLC法测定主要含有甘露醇(16.53%)、蔗糖(8.34%)、果糖(25.38%)、葡萄糖(7.75%)等单体成分。大肠杆菌脂多糖(lipopolysaccharide from Escherichia coli O55：B5，LPS)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)与0.33%中性红溶液均购自美国Sigma-Aldrich公司。一氧化氮(NO)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。环氧活化琼脂糖凝胶(Epoxy-activated Sepharose6B)购自瑞典GE healthcare公司。快速银染试剂盒购自碧云天生物技术研究所。质谱用甲酸和乙腈均购自美国Thermo Fisher Scientific公司。其余试剂均为国产分析纯。, 百拇医药(王丽超 刘丹 姜勇 屠鹏飞 曾克武)