BMP-2对体外培养人牙囊细胞表达OPG和RANKL的影响(2)
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参见附件(2070KB，4页)。
1.2.2RT-PCR法检测BMP-2对体外培养人牙囊细胞OPG、RANKL表达的影响
1.2.2.1 人牙囊细胞的处理:取第5代的人牙囊细胞,用2.5g/l的胰蛋白酶消化后,配成单细胞悬液,接种到直径为70mm的培养皿上,加含50ml/L FBS的高糖DMEM培养液5ml,次日去除未贴壁死细胞,当细胞汇合后,换含10ml/l FBS的DMEM培养3h后,加100ng/ml的BMP-2分别于0 h、1h、3h、6h、12 h、18h终止培养。
1.2.2.2 总RNA提取及检测:根据TRIzol Reagent产品说明提取总RNA,每个培养皿的细胞加1ml Trizol提取总RNA,室温作用5min后收集细胞样品,加入氯仿0.2ml充分混匀后室温作用2～3min,4℃下12 000r/min 离心15min,收集水相,加入0.5ml异丙醇混匀后室温作用10min。而后4℃下12 000r/min 离心10min,再用75%乙醇洗涤后,4℃下以7 500r/min离心5min,空气中自然干燥RNA后,用无RNA酶水溶解,取出少量稀释后用紫外分光光度计测定其浓度和纯度。根据测定值调整RNA标本浓度为1μg/μl,-70℃保存备用。
1.2.3 cDNA第一链合成及扩增:根据Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit 操作说明将5μg总RNA逆转录为cDNA,多聚酶链反应(PCR)条件为:94℃变性3min,94℃ 变性30s,58℃～59℃退火2s,4℃延伸30s,72℃延长5min,经过35个循环,1.2.4 引物序列及参数:见表1。
1.2.5PCR产物分析:取PCR扩增产物10μl点样于10g/L琼脂糖凝胶, DL2000 Maker10μl作参照,80V电压下电泳,于紫外线箱中观察并照相记录。
1.2.6统计学分析:用Bandscan 5.0对结果进行灰度值分析。以样品的OPG或RANKL的灰度值与同一样品β-actin的灰度值之比作为评价OPG或RANKL表达量的指标,数据采用方差分析,应用SPSS11.0软件统计学分析。
2结果
2.1 免疫组化法检测体外培养的人牙囊细胞OPG、RANKL蛋白的表达:人牙囊细胞胞浆中微弱表达OPG,空白组无表达,微弱表达RANKL,空白组无表达,如图1～5所示。
2.2BMP-2对体外培养人牙囊细胞OPG、RANKL表达的影响:如图5、表2所示BMP-2作用下HDFCs的OPG基因表达随时间逐渐增强,12h基因表达处于高峰(P<0.05),18h略有回落,RANKL的基因表达则相反,随时间逐渐下降,6h时表达降低显著(P<0.05),持续到12h,达到最低,以后略有回升。
3讨论
OPG属于肿瘤坏死因子受体(TNF-R)超家族,以外分泌的方式在胞外发挥作用,在体外OPG可以阻止破骨细胞(OC)的分化。OPG mRNA广泛表达于多种组织和细胞。
破骨细胞分化因子(RANKL)mRNA 主要表达在骨、骨髓和淋巴组织。表达于成骨细胞/基质细胞表面的RANKL与破骨细胞前体细胞表面的破骨细胞分化激活受体(RANK)结合,刺激前体破骨细胞分化,活化成熟的破骨细胞,引起骨吸收。研究发现RANKL基因敲除小鼠表现为严重的骨质硬化和牙萌出困难,体内破骨细胞数明显减少[1-2]。而OPG是RANKL的可溶性饵受体,竞争性的与RANKL结合,阻断RANKL与破骨细胞前体细胞膜上RANK结合,抑制破骨细胞性骨吸收和诱导破骨细胞的凋亡
从前的观点认为是OPG而不是RANKL表达于大鼠下颌第一磨牙的牙囊上[3]。他们的研究发现大鼠出生后第3天、小鼠出生后第5天第一磨牙OPG表达下降,在体外牙囊细胞与CSF-1和PTHrP共培养发现OPG的表达下降,因此可以推测CSF-1和PTHrP是OPG表达下降的原因,此时OPG基因表达减弱,增大了RANKL/OPG,使萌出牙周围牙槽骨表达的RANKL发挥更大的作用,导致了大量的破骨细胞出现[3]。但是新近的研究结果证明牙囊细胞也存在RANKL的表达[4],牙周膜也同时表达OPG和RANKL,也证明了牙囊细胞与牙周膜细胞的延续性。研究发现大鼠出生后第1～8天RANKL的表达没有明显变化,第9～11天出现一个小高峰,而OPG无明显变化,RANKL/OPG也升高,此时体内出现相应破骨细胞小高峰,而且体外研究发现,RANKL的表达受TNF-α、IL-1α、TGF-β的影响而增强[4],但是IL-1α和TGF -β在出生后早期表达于星网状层,而此时RANKL的表达水平没有明显变化,推测可能是信号转导通路受阻或者可能通过其他渠道影响破骨细胞形成。体外实验还证明BMP可以增强OPG的表达,降低RANKL的表达,推测BMP参与了根方牙槽骨的形成。
骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins,BMP)属于转移生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-βs)超家族成员,是一种多功能的生长因子,对胚胎骨形成及出生后成骨有重要的作用,BMP-2是一种刺激骨形成的蛋白,可上调成骨细胞系OPG的表达, BMP-2对牙囊细胞的作用,使它成为牙齿萌出过程中促进根部牙槽骨形成的刺激因子[5]。Zhao等[6]用BMP-2作用于永生化的鼠牙囊细胞,能诱导牙囊细胞向成骨细胞、成牙骨质细胞表型分化。Pan K等[7]的研究也发现BMP-2可以上调小鼠牙囊细胞成骨相关基因的表达 ......
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