反义结缔组织生长因子对人瘢痕疙瘩成纤维细胞的作用
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1.6逆转录-聚合酶链式反应：于转染后48h按照TRIzol说明书在培养瓶中提取总RNA，1%甲醛琼脂糖变性凝胶电泳检测RNA样本的完整性良好，并用RNA/DNA计算器检测RNA的浓度。取RNA2.0μg作逆转录，反应条件为70℃10min,37℃60min，99℃5min.取1μl逆转录产物为模板，三磷酸甘油醛脱氢酶(G3PDH)为外参照，将CTGF与G3PDH同等条件扩增。预期CTGF的扩增片段长度微766bp，上游引物为5，-GCCCAGACCCAACTATGA-3，下游引物为5，-ACCCTCCCAC TGCTCCTA-3，；G3PDH的扩增片段长度为450bp，上游引物为5，-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3，下游引物为5，-TCCACCACCCTG TTGCTGTA-3，。反应条件为：94℃预变3min、94℃变性40s、56℃退火 40s、72℃延伸40s，共循环30次,72℃延伸10min。取PCR产物5μl在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，用凝胶成像系统观察结果并照相，用计算机图象处理系统分析，计算目的基因、G3PDH基因条带相对吸光度。
1.7MTT法测成纤维细胞增殖每孔5×103个细胞接种于96孔培养板上，每组做三孔，取平均值。分别于转染6、12、24、48、72h取出一块培养板，用MTT法测定各孔光吸收值，以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。
1.83H-脯氨酸掺入法测成纤维细胞胶原蛋白合成：瘢痕疙瘩成纤维细胞1×104个/孔分种于24孔培养板上，于转染48h后吸弃上清液，加入3H-脯氨酸继续培养10h，多孔收集器收集细胞于玻璃纤维纸上，液闪测定仪闪烁记数测定3H-脯氨酸掺入量。每组设3个复孔。
1.9统计学分析：采用SPSS 10.0统计软件包，对各实验组数据进行单因素方差分析。
2实验结果
2.1 逆转录-聚合酶链式反应结果：CTGFmRNA在NSF组中表达极弱，在KF中表达增强，ASODN组CTGFmRNA表达减弱(图1)。CTGFmRNA的表达量经方差分析，CTGF ASODN组表达量(0.28±0.62)显著低于KF组(0.74±0.16)，差异有显著性意义(P<0.05)。
2.2 CTGFASODN对成纤维细胞生长曲线的影响：NSF组、KF组曲线逐渐升高，其中KF组升高幅度明显大于NSF组；而KF+CTGFASODN组在转染后第6h生长曲线明显呈下降趋势，至72h降至最低(见图2)。
2.3 CTGFASODN对KF胶原合成的作用：利用3H-脯氨酸掺入，在无血清培养的条件下，观察CTGFASODN对KF胶原合成的影响。其中，KF组中胶原合成量(5891±182)明显较NSF组(1367±218)增多 (P<0.05)；而CTGFASODN对KF胶原合成(3487±629)有明显抑制作用,差异有显著性意义(P<0.05)。
3讨论
在许多纤维化疾病中CTGF与TGF-β1的表达同步增高[6]。Grotendorst等[7]发现，在CTGF启动子-162～-128核苷酸序列中有一个TGF-β1反应元件，其点突变可以导致TGF-β1活性完全丧失，故认为CTGF是TGF-β1致纤维化作用的直接下游效应介质。
反义寡核苷酸技术是根据核酸间结合需遵循碱基互补原则这一原理，使用与目的基因特定互补的短核苷酸片段阻断目的基因的表达。脂质体具有安全、高效、使用方便和无免疫原性等优点，可以使细胞摄取寡核苷酸的能力增加10～20倍。
研究结果显示，从mRNA水平看，CTGF在正常皮肤成纤维细胞中表达极其微弱，在瘢痕疙瘩成纤维细胞中表达增高，因此我们推测在瘢痕疙瘩纤维进程中，可能伴随着CTGF DNA向mRNA转录过程的启动以及高水平转录的持续存在，进而翻译成CTGF蛋白质，后者发挥生物学活性刺激组织中成纤维细胞增殖和外基质合成增加，增殖的成纤维细胞又产生更多的CTGF，这样恶性循环，最终形成大量的纤维化组织，导致瘢痕形成。
MTT是一种淡黄色唑氮盐，是线粒体脱氢酶的作用底物，经活细胞内线粒体脱氢酶的消化作用，被还原成不溶于水的蓝紫色form azan的结晶。结晶溶解后，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定光吸收值，来反映细胞的增殖能力和存活情况。体外培养的KF的MTT生长曲线结果显示CTGFASODN能明显抑制瘢痕成纤维细胞的增殖活性，表现为生长曲线逐 渐下降。
胶原蛋白是细胞外基质中最活跃的成分之一，是创面愈合和瘢痕形成的关键因素，胶原蛋白的异常合成与沉积是病理性瘢痕的基础。可以通过检测3H标记的脯氨酸掺入胶原的量来分析胶原合成速度，3H-脯氨酸掺入结果显示，CTGFASODN能够抑制体外培养的KF合成胶原。
由于RT-PCR证实ASODN转染后KF中CTGFmRNA表达水平较KF降低，证明CTGFASODN抑制KF增殖并抑制其胶原合成，均是由于其有效的抑制了KF内CTGF的基因转录，说明CTGF ASODN成功地发挥了其反义抑制作用。
许多年以来， TGF-β1被认为是促进瘢痕纤维化的最重要的生长因子之一[8]，但他同时也是一种有效的免疫调节剂，具有抗炎等重要生物学活性，研究表明新生小鼠敲除TGF-β1基因，在出生后很快死于全身炎症，鉴于TGF-β1作用的靶细胞种类繁多、生物学效应复杂，因此完全阻断其表达或活性的后果是难以预料的[9-11]。相比之下，CTGF作为TGF-β1的下游效应因子，特异性介导TGF-β1的促纤维化效应 ......
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