rhBMP2作用下人牙周膜成纤维细胞中cbfα1的表达研究
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1材料和方法
1.1 主要试剂及仪器：Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶(Gibco公司)，ABC免疫组化试剂盒(Vector，USA波形丝蛋白抗体，角蛋白抗体,rhBMP2(第四军医大学生化教研室)，总RNA提取试剂盒TRIzol Reagent(Invitrogen公司)，紫外分光光度计(Amersham Biosciences Ultrospec 2100 pro)，反转录酶M-MLV Reverse Transcriptase (200Uμl)(Promega公司)，反转录缓冲液M-MLV RT 5××Reaction Buffer (Promega公司)，DNTP(10mM)天为时代，DNA MARKERⅢ(天为时代)。
1.2 HPDLfs的体外培养及实验分组：①取材：取11～14岁因正畸矫治需要而拔除的健康年轻恒牙，采用组织块消化培养法进行培养。②无菌处理：在超净台内用含双抗的PBS从牙齿根方向冠方冲洗牙齿数次，用无菌手术刀片刮取牙根中部1/3处的牙周膜组织。③收集消化：将刮下的牙周膜组织置于PBS液中，移入离心管，离心(800r/6min)，收集牙周膜组织，加入10倍体积的浓度为2%的Ⅰ胶原酶，置于CO2孵箱消化。④接种：约2h后，组织呈絮状后，离心后收集组织，弃去胶原酶，加入含10%小牛血清(FCS)，100μ/ml青霉素，100μ/ml链霉素的DMEM(低糖)培养液，充分吹打细胞悬液，接种于6孔培养板。接种量为每孔接种1颗牙齿的牙周组织量。⑤孵育：置于CO2孵箱，37℃培养。3天内保持培养板静置，以利于组织贴壁。最早于第3天可见有细胞从组织块中游出。当细胞生长达到孔板的30%时，进行细胞分散后，继续培养，期间常规换液。⑥传代：待细胞覆盖孔板底达60%时，进行首次传代。传代时弃去旧培养液，加入0.25%胰蛋白酶2～3滴，以覆盖孔底为宜，室温下消化，2～3min，镜下观察，发现胞质回缩、细胞间隙增大后，立即终止消化，弃去上清，加入2ml培养液，充分吹打制成细胞悬液，以1:1将细胞悬液移入15ml培养瓶，加入足量培养液培养。以后以1:2进行传代。免疫组化ABC法进行波形丝蛋白和细胞角蛋白抗体染色，作细胞来源鉴定。
为检测不同浓度rhBMP2对体外HPDLfs中cbfα1mRNA表达的影响，用高压灭菌生理盐水将rhBMP2冻干粉配制成25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml 3个浓度组。各浓度组分别观察作用1、3、5、7天后，HPDLfs中cbfα1mRNA表达的变化。
分组设计为：对照组：HPDLfs+2%DMEM；B1组：25ng/ml rhBMP2+HPDLfs+2%DMEM；B2组：50ng/ml rhBMP2+HPDLfs+2%DMEM；B3组：100ng/ml rhBMP2 +HPDLfs+2%DMEM。
取4块6孔培养板，4个作用时间点各1块。各培养板为3个浓度组及相应对照组。每孔接种细胞悬液2ml，在标准环境下以含10%FCS的DMEM培养液孵育24h后，弃去培养液及未贴壁的细胞。实验组分别加入rhBMP2，终浓度为25、50、100ng/ml，含2%FCS的DMEM培养，对照组为仅含2%FCS的DMEM。作用1、3、5、7天后进行检测。
1.3 反转录聚合酶链反应检测cbfα1的表达
1.3.1细胞总RNA的提取：弃去每孔的培养液，每孔用1×PBS 2ml洗1遍，弃去PBS加入1mlTRIzol。
1.3.1.1溶解分离：①用移液器将细胞从孔底吹下，吹打壁上的细胞，0～15℃静止5min，移入ep管中。②加入200μl氯仿震荡15s，15～30℃度静止2～3min，离心(12 000r/15min)。
1.3.1.2沉淀RNA：①吸出上层水相，移入新的ep管中；②加入500μl的异丙醇，15～30℃孵育10min，2～8℃，离心(12 000r/10min)，弃上清。
1.3.1.3洗涤：①加入1ml 70%乙醇(DEPC水配制)涡旋2～8min，离心(7 500r/5min)；②室温干燥5～10min。
1.3.1.4溶解：加入20μl DEPC水溶解RNA，55～60℃孵育10min。
1.3.1.5保存：-70℃保存备用。
1.3.2 反转录：紫外分光光度计定量取2μg总mRNA，加入1μg oligodT，70℃水浴10min后，立即置于冰上；加入 M-MLV 5×Buffer 5μl，10mM dNTP 4μl，200U/μlM-MLVRT 1μl，42℃水浴锅中60min。
1.3.3 PCR扩增
1.3.3.1引物设计
①cbfa1的分子引物序列：该引物将产生333bp的cDNA片断。
上游引物5' GCTTCAACTGGGCCCTTTTTCAG 3'
下游引物5' CCATCAGCGTCAACACCATCATTC 3'
②β-actin分子引物序列：该引物序列由北京三博远志生物技术有限公司合成。
上游引物5'TCCTGTGGCATCCATGAAACT3'
下游引物5'AACGCAGCTCAGTAACAGTC3'
1.3.3.2 PCR条件：在20μl的反应体系中，模板cDNA第1条链是1μl，cbfa1引物(10pm/μl)1μl，dNTP (10mM) 2μl，Mg++(25mM) 1μl，10×PCR Buffer2ul，tag plus DNA聚合酶0.5μl加灭菌水至20μl。反应条件为94℃变性 4min，94℃30s，54.5℃30s，72℃1.5min ......
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