MAGE-A9基因原核表达系统的构建及其在肝细胞癌中的表达(2)
 |
| 第1页 |
参见附件(460KB，4页)。
1.2 方法
1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank中MAGE-A9基因序列设计引物P1：5CACAAGCTTCGGACTCC CTCTTCCTCCTCTCT 3；P2：5CCGGAATTCGAATGT CTCTTGAGCAGAGGAGT 3，分别引入Hind III 和EcoR I酶切位点,由北京赛百盛公司合成。
1.2.2 肝癌组织总RNA制备及RT-PCR扩增 Trizol一步法提取肝癌组织总RNA，将抽提产物溶于DEPC处理的双蒸水中，以P1和P2为引物作RT-PCR扩增:94 ℃ 4 min预变性，94 ℃ 50 s变性，58 ℃ 50 s退火，72 ℃ 60 s延伸，共30个循环，72 ℃终末延伸7 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.2.3 MAGE-A9基因的克隆 RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收纯化, 将纯化的PCR产物与pMD18-T载体进行T-A克隆重组, 连接产物转化感受态大肠杆菌TG1,蓝白斑筛选阳性克隆, PCR初步鉴定阳性克隆后,进行DNA 序列分析。碱裂解法提取阳性重组体pMD18-T- MAGE-A9质粒, 用EcoR I、 Hind III 酶切, 酶切产物与同样酶切的表达载体pBAD/gIII用T4 DNA连接酶连接。连接产物转化感受态大肠杆菌TG1,氨苄平板筛选阳性克隆。提取阳性克隆菌质粒,以EcoR I、Hind III 酶切, 1%琼脂糖凝胶电泳初步鉴定阳性克隆,所得重组质粒命名为pBAD/gIII-MAGE-A9。
1.2.4 MAGE-A9基因的诱导表达及纯化 取1μl质粒pBAD/gIII-M9转化感受态大肠杆菌Top10, 氨苄平板筛选. 挑取单个阳性克隆培养至A600 nm=0.5,加入左旋阿拉伯糖(终浓度为0.002%)，于37 ℃
剧烈震荡诱导表达4 h后收菌,PBS 重悬,超声裂解,低温离心,取上清 ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(460KB，4页)。