262例乙型肝炎患者YMDD变异的检测及分析
参见附件(12kb)。
【关键词】 慢性乙型肝炎；实时荧光PCR；YMDD变异
拉米夫啶是常用的核苷类抗乙型肝炎病毒(HBV)药物，对HBV有明显的抑制作用，但随着拉米夫啶的广泛应用，许多文献报道已证明YMDD变异是引起拉米夫啶耐药的机制，为了解慢性乙型肝炎患者YMDD变异的存在状况，对262例慢性乙型肝炎患者进行了HBV DNA YMDD变异的检测，现报道如下：
1 材料与方法
1.1 一般材料 262例血清样本均来自中山大学附属第二医院2009年9月至2010年6月收治的慢性乙型肝炎患者，全部病例符合2000年9月西安会议修订的《病毒性肝炎防治方案》中慢性乙型肝炎的诊断标准。
1.2 仪器与试剂 ABI 7500荧光定量PCR仪，来自美国应用生物系统公司；乙型肝炎病毒核酸扩增(PCR)荧光定量测定及YMDD变异检测试剂盒，来自艾康生物技术(杭州)有限公司。
1.3 标本采集 用一次性注射器抽取患者静脉血1～2 ml，置于灭菌的一次性试管中(不可用肝素抗凝)，3000～4000 rpm离心20 min，分离血清，-20℃保存不超过7天。
1.4 检测方法 采用乙型肝炎特异引物及特异Taqman MGB探针，并结合FQ-PCR技术，同时检测HBV载量以及YMDD变异情况。取待测血清样本、强阳性、临界阳性、阴性血清对照品各50 ul于1.5 ml灭菌离心管中，分别加入50 ul核酸提取液，混匀后2000rpm离心10sec，100℃水浴10 min,12000 rpm离心10 min；按试剂盒要求配置反应混合液并进行操作，每个测试样本平行用A、B、C反应混合液来检测，选择37℃ 2 min,95℃ 5 min，再按94℃ 20sec→62℃ 60sec循环40次进行PCR扩增反应。在62℃采集FAM荧光信号。
1.5 结果判断 基线调整取2～15个循环的荧光信号，阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点，检测符合质控标准。根据HBV反应混合液A的结果进行HBV DNA定量。YMDD变异分析：样品反应混合液B检测阴性，反应混合液C检测阳性，判该样品为YIDD变异株；样品反应混合液B检测阳性，反应混合液C检测阴性，判该样品为YVDD变异株；样品反应混合液B检测阴性，反应混合液C检测阴性，判该样品为野生型株；样品反应混合液B检测阳性 ......
【关键词】 慢性乙型肝炎；实时荧光PCR；YMDD变异
拉米夫啶是常用的核苷类抗乙型肝炎病毒(HBV)药物，对HBV有明显的抑制作用，但随着拉米夫啶的广泛应用，许多文献报道已证明YMDD变异是引起拉米夫啶耐药的机制，为了解慢性乙型肝炎患者YMDD变异的存在状况，对262例慢性乙型肝炎患者进行了HBV DNA YMDD变异的检测，现报道如下：
1 材料与方法
1.1 一般材料 262例血清样本均来自中山大学附属第二医院2009年9月至2010年6月收治的慢性乙型肝炎患者，全部病例符合2000年9月西安会议修订的《病毒性肝炎防治方案》中慢性乙型肝炎的诊断标准。
1.2 仪器与试剂 ABI 7500荧光定量PCR仪，来自美国应用生物系统公司；乙型肝炎病毒核酸扩增(PCR)荧光定量测定及YMDD变异检测试剂盒，来自艾康生物技术(杭州)有限公司。
1.3 标本采集 用一次性注射器抽取患者静脉血1～2 ml，置于灭菌的一次性试管中(不可用肝素抗凝)，3000～4000 rpm离心20 min，分离血清，-20℃保存不超过7天。
1.4 检测方法 采用乙型肝炎特异引物及特异Taqman MGB探针，并结合FQ-PCR技术，同时检测HBV载量以及YMDD变异情况。取待测血清样本、强阳性、临界阳性、阴性血清对照品各50 ul于1.5 ml灭菌离心管中，分别加入50 ul核酸提取液，混匀后2000rpm离心10sec，100℃水浴10 min,12000 rpm离心10 min；按试剂盒要求配置反应混合液并进行操作，每个测试样本平行用A、B、C反应混合液来检测，选择37℃ 2 min,95℃ 5 min，再按94℃ 20sec→62℃ 60sec循环40次进行PCR扩增反应。在62℃采集FAM荧光信号。
1.5 结果判断 基线调整取2～15个循环的荧光信号，阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点，检测符合质控标准。根据HBV反应混合液A的结果进行HBV DNA定量。YMDD变异分析：样品反应混合液B检测阴性，反应混合液C检测阳性，判该样品为YIDD变异株；样品反应混合液B检测阳性，反应混合液C检测阴性，判该样品为YVDD变异株；样品反应混合液B检测阴性，反应混合液C检测阴性，判该样品为野生型株；样品反应混合液B检测阳性 ......
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