纤溶酶原激活物抑制剂—1及其基因启动子区4G/5G多态性在大肠癌与癌旁组织中的表达及意义(2)
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参见附件。
1.2 主要仪器与试剂
PCR仪(美国Sigma公司)，电泳仪(AE-8130，日本，ATTO公司)，凝胶成像系统(UVP Mini，美国，UVP公司)，multiskan ascent 多功能酶标仪(The mo，美国)，PAI-1(ELISA)试剂盒(厦门慧嘉生物科技有限公司)。
1.3 组织PAI-1基因启动子区4G/5G多态性测定
1.3.1 标本采集 切取患者组癌变大肠组织和癌旁正常大肠组织(距离癌变组织至少20 cm以上)各约1 cm×1 cm冰冻保存。
1.3.2 组织标本DNA提取 将组织块解冻，用生理盐水洗去血污，剪取约0.5 g组织，放入1.5 ml离心管中，剪碎，盐析法提取组织白细胞DNA，-20 ℃保存。
1.3.3 PCR引物合成 PCR扩增引物设计参照文献[4](详见表1)。
表1 PAI-1基因启动子区4G/5G特异性PCR引物序列
引物名称引物序列产物大小
P1(插入型5G)5’GTCTGGACACGTGGGGG3’140 bp
P2(缺失型4G)5’GTCTGGACACGTGGGGA3’139 bp
P3 5’TGCAGCCAGCCACGTGATTGTCTA3’
1.3.4 PAI-1基因的PCR扩增 每一份DNA标本同时进行两个体系PCR反应，即P1P3和P2P3反应体系。总反应体系25 μl，首先94 ℃预变性5 min，后94 ℃变性45 s，62 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min共30个循环，终末72 ℃延伸7 min ......
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